一、禽流感流行現(xiàn)狀與防控需求

禽流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一類(lèi)禽類(lèi)傳染病的總稱(chēng)，根據(jù)病毒致病性可分為高致病性、低致病性和非致病性三類(lèi)。其中高致病性禽流感發(fā)病急、傳播快，病死率可達(dá)100%，一旦暴發(fā)會(huì)導(dǎo)致禽類(lèi)大規(guī)模死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨額經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，H5N1、H7N9等亞型禽流感病毒可突破種間屏障感染人類(lèi)，引發(fā)重癥肺炎甚至死亡，構(gòu)成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅。因此，建立快速、準(zhǔn)確、高效的診斷技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)禽流感的早期發(fā)現(xiàn)、精準(zhǔn)防控，對(duì)保障養(yǎng)殖業(yè)安全和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

二、傳統(tǒng)禽流感診斷方法的局限

目前禽流感診斷方法主要包括病毒分離培養(yǎng)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、血清學(xué)檢測(cè)等。病毒分離培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，具有特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但操作復(fù)雜、培養(yǎng)周期長(zhǎng)（需3-7天），且對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí)要求高，難以滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速診斷需求；RT-PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好，但依賴(lài)精密的核酸提取與擴(kuò)增設(shè)備，試劑成本較高，對(duì)操作人員專(zhuān)業(yè)技能要求嚴(yán)格，在基層實(shí)驗(yàn)室推廣受限；傳統(tǒng)血清學(xué)方法如血凝抑制試驗(yàn)（HI）操作繁瑣，主觀性較強(qiáng)，檢測(cè)效率低，無(wú)法適應(yīng)大規(guī)模樣本篩查。

三、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、樣本來(lái)源：收集近年來(lái)自全國(guó)5個(gè)禽類(lèi)養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)的臨床樣本共320份，包括雞血清210份、鴨血清70份、鵝血清40份，所有樣本均經(jīng)冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/span>

2、試劑：禽流感病毒（H5+H7亞型）抗體檢測(cè)ELISA試劑盒，包含包被抗原板、酶標(biāo)二抗、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、底物溶液 A/B、終止液等；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）、吐溫-20等均為分析純?cè)噭?/span>

3、儀器：博清生物酶標(biāo)儀；恒溫水浴鍋；移液器；離心機(jī)。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、樣本預(yù)處理：將冷凍保存的血清樣本室溫解凍后，3000r/min離心5min，取上清液備用，避免溶血樣本納入檢測(cè)。

2、ELISA檢測(cè)操作：嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)及博清生物酶標(biāo)儀操作指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。①加樣：將陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，待檢樣本設(shè)2個(gè)重復(fù)孔，每孔加入100μL 對(duì)應(yīng)血清樣本，37℃孵育60min；②洗滌：棄去孔內(nèi)液體，用含0.05% 吐溫-20的PBS緩沖液洗滌5次，每次浸泡30s，拍干；③加酶標(biāo)二抗：每孔加入100μL 酶標(biāo)二抗，37℃孵育30min，重復(fù)洗滌步驟；④顯色：每孔依次加入50μL底物溶液A和B，避光37℃孵育15min；⑤終止：每孔加入50μL終止液，輕輕振蕩混勻。

3、儀器檢測(cè)參數(shù)設(shè)置：使用博清生物酶標(biāo)儀。通過(guò)儀器自帶數(shù)據(jù)分析軟件，以（待檢樣本OD值/陽(yáng)性對(duì)照OD值）×100%計(jì)算S/P值，S/P≥0.4判定為陽(yáng)性，S/P<0.4判定為陰性。

4、對(duì)比實(shí)驗(yàn)：采用病毒分離培養(yǎng)法（金標(biāo)準(zhǔn)）和RT-PCR法對(duì)所有樣本進(jìn)行平行檢測(cè)，以金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果為參照，計(jì)算博清生物酶標(biāo)儀的診斷性能指標(biāo)。

5、重復(fù)性試驗(yàn)：選取10份陽(yáng)性樣本和10份陰性樣本，在同一批次內(nèi)連續(xù)檢測(cè)3次（批內(nèi)重復(fù)），并在不同日期檢測(cè)3次（批間重復(fù)），計(jì)算各樣本OD值的變異系數(shù)（CV），評(píng)估儀器檢測(cè)重復(fù)性。

（三）數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，變異系數(shù)計(jì)算采用 CV=（標(biāo)準(zhǔn)差/均數(shù)）×100%。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、結(jié)果

（一）博清生物酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性

320份臨床樣本經(jīng)病毒分離培養(yǎng)法檢測(cè)，陽(yáng)性樣本122份，陰性樣本198份。博清生物酶標(biāo)儀檢測(cè)出陽(yáng)性樣本120份，陰性樣本197份，其中真陽(yáng)性120份，真陰性195份，假陽(yáng)性3份，假陰性2份。診斷靈敏度為98.3%（120/122），特異性為97.8%（195/198），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.6%（120/123），陰性預(yù)測(cè)值為98.5%（195/198），總符合率為98.0%（315/320）。Kappa一致性檢驗(yàn)顯示，Kappa值=0.958（P<0.001），表明博清生物酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)具有極高的一致性。

（二）檢測(cè)靈敏度與特異性分析

對(duì)10份梯度稀釋的禽流感病毒陽(yáng)性血清（稀釋度1:100至1:12800）進(jìn)行檢測(cè)，博清生物酶標(biāo)儀可穩(wěn)定檢出最低稀釋度為1:6400的陽(yáng)性樣本，而傳統(tǒng)HI試驗(yàn)僅能檢出1:1600及以上稀釋度樣本，表明其靈敏度顯著高于傳統(tǒng)血清學(xué)方法。特異性試驗(yàn)中，采用新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、鴨瘟病毒等8種常見(jiàn)禽類(lèi)疫病陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，博清生物酶標(biāo)儀均檢出為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)，特異性達(dá)100%。

（三）重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中，20份樣本OD值的CV范圍為1.2%-2.8%，平均CV為1.9%；批間重復(fù)性試驗(yàn)中，CV范圍為2.5%-4.6%，平均CV為3.7%，均低于ELISA檢測(cè)技術(shù)規(guī)范中CV≤5% 的要求，表明博清生物酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果具有良好的穩(wěn)定性與重復(fù)性。

五、討論

（一）博清生物酶標(biāo)儀的核心性能優(yōu)勢(shì)

本研究結(jié)果表明，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀在禽流感診斷中表現(xiàn)出優(yōu)異的綜合性能。其高靈敏度得益于儀器采用的8通道光纖檢測(cè)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)微弱光信號(hào)的精準(zhǔn)捕捉，結(jié)合雙波長(zhǎng)檢測(cè)模式有效剔除背景干擾，使得低濃度抗體樣本得以準(zhǔn)確檢出，這對(duì)于禽流感早期感染的發(fā)現(xiàn)及疫情預(yù)警具有重要意義。在特異性方面，儀器通過(guò)優(yōu)化光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及信號(hào)處理算法，有效避免了交叉反應(yīng)導(dǎo)致的誤診，為診斷結(jié)果的可靠性提供了保障。

重復(fù)性作為衡量檢測(cè)設(shè)備穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)，博清生物酶標(biāo)儀在批內(nèi)及批間試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較低的變異系數(shù)，這與其采用的高精度加樣控制技術(shù)及恒溫孵育系統(tǒng)密切相關(guān)。儀器自帶的智能化數(shù)據(jù)分析軟件可自動(dòng)完成數(shù)據(jù)讀取、計(jì)算及結(jié)果判定，減少了人工操作誤差，進(jìn)一步提升了檢測(cè)結(jié)果的一致性。此外，該儀器操作界面簡(jiǎn)潔直觀，無(wú)需專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員即可快速掌握，且檢測(cè)成本顯著低于RT-PCR法，更適合基層實(shí)驗(yàn)室及大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查場(chǎng)景的應(yīng)用。

（二）與同類(lèi)診斷技術(shù)的對(duì)比價(jià)值

相較于傳統(tǒng)診斷方法，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀結(jié)合ELISA技術(shù)的診斷方案在效率、成本及適用性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。病毒分離培養(yǎng)法雖為金標(biāo)準(zhǔn)，但操作復(fù)雜且周期長(zhǎng)，無(wú)法滿(mǎn)足疫情應(yīng)急處置的快速響應(yīng)需求；RT-PCR技術(shù)雖靈敏度高，但依賴(lài)昂貴的儀器設(shè)備及試劑，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及操作人員技能要求嚴(yán)格，難以在基層防疫機(jī)構(gòu)普及。博清生物酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)了“高性能-低成本-易操作”的平衡，單次檢測(cè)成本僅為RT-PCR法的1/3，且檢測(cè)周期縮短近40%，能夠有效填補(bǔ)基層禽流感診斷技術(shù)的短板。

與同類(lèi)酶標(biāo)儀產(chǎn)品相比，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀在光學(xué)精度及智能化程度上表現(xiàn)突出。其波長(zhǎng)精度達(dá)±2nm，吸光度分辨率為0.001A，優(yōu)于行業(yè)平均水平（波長(zhǎng)精度±3nm，分辨率0.005A），確保了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；自帶的樣本信息管理系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的自動(dòng)存儲(chǔ)、導(dǎo)出及追溯，符合實(shí)驗(yàn)室信息化管理需求。此外，儀器采用的長(zhǎng)壽命光源系統(tǒng)（使用壽命≥10000小時(shí)）降低了后期維護(hù)成本，進(jìn)一步提升了產(chǎn)品的性?xún)r(jià)比。

（三）實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)化方向與前景

在實(shí)際應(yīng)用中，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性除依賴(lài)儀器性能外，還與試劑盒質(zhì)量、樣本處理流程密切相關(guān)。因此，建議在使用博清生物酶標(biāo)儀進(jìn)行禽流感診斷時(shí)，選擇經(jīng)過(guò)國(guó)家獸藥GMP認(rèn)證的ELISA試劑盒，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣本預(yù)處理及檢測(cè)操作，以確保結(jié)果可靠。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣本（如嚴(yán)重溶血或脂血血清），可通過(guò)儀器軟件的背景校正功能進(jìn)一步降低干擾，提升檢測(cè)準(zhǔn)確性。

隨著禽流感防控工作的常態(tài)化推進(jìn)，對(duì)快速診斷技術(shù)的需求將持續(xù)增長(zhǎng)。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀可進(jìn)一步拓展應(yīng)用場(chǎng)景，如結(jié)合多重ELISA技術(shù)實(shí)現(xiàn)多亞型禽流感病毒的同步檢測(cè)，或與便攜式檢測(cè)設(shè)備聯(lián)用開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)快速診斷系統(tǒng)。未來(lái)，通過(guò)整合人工智能算法，有望實(shí)現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)分析及疫情趨勢(shì)預(yù)測(cè)，為禽流感精準(zhǔn)防控提供更有力的技術(shù)支撐。

本研究通過(guò)系統(tǒng)的性能評(píng)估證實(shí)，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀在禽流感診斷中具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、檢測(cè)效率高的特點(diǎn)，與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果具有極高的一致性，且操作簡(jiǎn)便、成本適中，能夠滿(mǎn)足基層實(shí)驗(yàn)室臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查及大規(guī)模樣本篩查的需求。該儀器的推廣應(yīng)用將有效提升我國(guó)禽流感疫情的早期發(fā)現(xiàn)能力和應(yīng)急處置效率，為養(yǎng)殖業(yè)安全及公共衛(wèi)生安全提供重要技術(shù)保障。