一、食品安全與檢疫中微生物檢測的現(xiàn)狀

在食品安全與檢疫領(lǐng)域，眾多微生物對人體健康和食品質(zhì)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

沙門氏菌是常見的食源性致病菌，其血清型超過2500種，部分能導(dǎo)致人類腸熱癥。據(jù)統(tǒng)計，在全球各類細(xì)菌性食物中毒事件中，由沙門氏菌引發(fā)的案例常居首位。2023 年美國東北部發(fā)生的牛肉末污染事件，致使至少16人感染，6人住院治療；2024 年蘇州的食物中毒事件，也是因人員食用了被沙門氏菌污染的食物，在晚宴后出現(xiàn)腹瀉等癥狀。人體感染沙門氏菌后，通常會出現(xiàn)發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，幼兒、老年人及免疫力低下人群感染后，病菌可能進(jìn)入血液，引發(fā)菌血癥，少數(shù)人還會合并腦膜炎或骨髓炎，嚴(yán)重時可危及生命。

李斯特菌也是不容忽視的食源性致病菌，主要通過污染的食物傳播，常見于未經(jīng)充分加熱的熟食、生食和一些奶制品中。雖然李斯特菌癥可影響任何人，但嬰兒、老年人、孕婦及其新生兒以及免疫系統(tǒng)受損的人群更容易受到嚴(yán)重感染。孕婦一旦感染李斯特菌，可能導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)或新生兒嚴(yán)重感染；對于一般成年人和兒童，感染后可能表現(xiàn)為輕微的流感樣癥狀，如發(fā)熱、肌肉痛、惡心和腹瀉；而免疫系統(tǒng)受損的人群，感染后可能引發(fā)更嚴(yán)重的癥狀，如腦膜炎（表現(xiàn)為頭痛、頸部僵硬、混亂、耐光性、發(fā)燒等）和敗血癥。

二、博清生物熒光定量PCR儀在微生物快速檢測中的應(yīng)用實例

（一）檢測流程

1、樣本采集：根據(jù)不同的食品類型，采用合適的采樣方法。對于肉類，使用無菌刀具在肉塊不同部位采集適量組織，將采集的樣本迅速放入無菌采樣袋中，并做好標(biāo)記；乳制品則可直接用無菌吸管吸取適量液體裝入無菌采樣瓶；果蔬需用無菌紗布擦拭表面后，用無菌打孔器在表皮和內(nèi)部組織分別采集多個樣本，混合后放入無菌容器。采集過程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免外界微生物污染樣本，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，采樣數(shù)量應(yīng)根據(jù)檢測要求和統(tǒng)計學(xué)原理確定，以保證樣本的代表性。

2、核酸提取：采用磁珠法進(jìn)行核酸提取，該方法利用表面修飾的磁性微珠和核酸結(jié)合，通過磁場分離核酸和雜質(zhì)，最后洗脫核酸。首先將采集的樣本加入裂解液和蛋白酶K，在60℃條件下孵育15分鐘，以充分破壞細(xì)胞或病毒，釋放核酸。然后加入磁珠懸浮液，輕輕混勻，在室溫下孵育5分鐘，使磁珠與核酸充分結(jié)合 。接著將反應(yīng)管置于磁力架上，待磁珠吸附在管壁后，小心吸棄上清液。用洗滌緩沖液洗滌磁珠3次，每次洗滌后都要充分混勻并短暫離心，再置于磁力架上吸棄上清液，以去除蛋白質(zhì)、鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)。最后用低鹽緩沖液（如ddH?O或TE）洗脫核酸，得到純凈的DNA或RNA，將提取的核酸保存于-20℃冰箱中備用。

3、PCR擴(kuò)增：在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，需準(zhǔn)備好反應(yīng)體系。根據(jù)實驗需求，準(zhǔn)備引物、探針、酶、緩沖液、dNTPs等試劑。引物和探針的設(shè)計應(yīng)具有高度特異性，針對目標(biāo)微生物的保守基因序列進(jìn)行設(shè)計，以確保能夠準(zhǔn)確檢測到目標(biāo)微生物。例如，檢測大腸桿菌O157:H7時，可選擇其特異性的志賀毒素基因（stx）作為靶基因設(shè)計引物和探針。將處理好的樣本核酸和試劑按一定比例加入到PCR反應(yīng)管中，總體積一般為20-25μl。反應(yīng)體系中各成分的濃度需經(jīng)過優(yōu)化，以保證擴(kuò)增效果。將PCR反應(yīng)管放入博清生物熒光定量PCR儀中，設(shè)置合適的反應(yīng)程序。一般先進(jìn)行預(yù)變性，在95℃下保溫10分鐘，以激活熱啟動DNA聚合酶，并使模板DNA充分變性；然后進(jìn)入循環(huán)階段，進(jìn)行40次循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性15秒、60℃退火和延伸60秒；最后進(jìn)行熔解曲線分析，從75℃逐漸升溫至95℃，每20秒升溫1℃，同時監(jiān)測熒光信號的變化。在儀器運(yùn)行過程中，要密切關(guān)注儀器的狀態(tài)和熒光信號的變化情況，確保擴(kuò)增反應(yīng)正常進(jìn)行。

4、結(jié)果分析：實驗結(jié)束后，儀器自動生成結(jié)果，包括擴(kuò)增曲線和Ct值等。擴(kuò)增曲線是以熒光信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制的曲線，理想的擴(kuò)增曲線應(yīng)呈現(xiàn)出典型的S型，即起始階段熒光信號較弱，隨著循環(huán)數(shù)的增加，熒光信號逐漸增強(qiáng)，進(jìn)入指數(shù)增長期，最后達(dá)到平臺期。Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值與模板起始濃度呈負(fù)相關(guān)，即模板起始濃度越高，Ct值越小。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，可以確定樣本中目標(biāo)微生物的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)品的初始模板濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)繪制而成。使用配套的軟件對結(jié)果進(jìn)行分析和處理，根據(jù)實驗?zāi)康倪M(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、比較和判斷。如果樣本的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中目標(biāo)微生物的含量；若Ct值大于設(shè)定的閾值或未出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，則判定為陰性結(jié)果，表明樣本中未檢測到目標(biāo)微生物或微生物含量低于檢測限。同時，還需對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，例如設(shè)置無模板對照（NTC）和陽性對照，無模板對照應(yīng)無擴(kuò)增曲線或Ct值大于設(shè)定閾值，以確保反應(yīng)體系無污染；陽性對照應(yīng)出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線且Ct值在預(yù)期范圍內(nèi)，以驗證實驗的有效性。

（二）實際案例分析

1、肉類檢測：在某肉類加工企業(yè)的日常檢測中，采用博清生物熒光定量PCR儀對一批豬肉原料進(jìn)行沙門氏菌檢測。同時，用傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為對照 。傳統(tǒng)培養(yǎng)法按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》進(jìn)行，首先將樣品進(jìn)行前增菌和選擇性增菌，然后進(jìn)行分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)鑒定，整個過程耗時約4-5天。而使用博清生物熒光定量PCR儀檢測時，從樣本采集到得到檢測結(jié)果僅需3-4小時。在檢測的100份豬肉樣本中，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測出5份陽性樣本，博清生物熒光定量PCR儀檢測出6份陽性樣本。進(jìn)一步對這6份樣本進(jìn)行復(fù)核，發(fā)現(xiàn)其中1份樣本的微生物含量極低，傳統(tǒng)培養(yǎng)法因靈敏度不足而漏檢。這表明博清生物熒光定量PCR儀在檢測速度上具有顯著優(yōu)勢，能夠快速判斷肉類原料是否受到沙門氏菌污染，及時采取措施，避免受污染的產(chǎn)品進(jìn)入后續(xù)加工環(huán)節(jié)；同時，其靈敏度更高，能夠檢測出低濃度的微生物污染，有效保障肉類產(chǎn)品的安全。

2、乳制品檢測：某乳制品生產(chǎn)企業(yè)懷疑一批牛奶受到大腸桿菌污染，分別使用博清生物熒光定量PCR儀和常規(guī)PCR法進(jìn)行檢測。常規(guī)PCR法檢測流程包括樣本處理、PCR擴(kuò)增、電泳檢測等步驟，整個檢測過程需要約6-8小時 。博清生物熒光定量PCR儀檢測同樣從樣本采集開始，經(jīng)核酸提取、PCR擴(kuò)增到結(jié)果分析，全程僅需3-5小時。對100份牛奶樣本檢測后，常規(guī)PCR法檢測出8份陽性樣本，博清生物熒光定量PCR儀檢測出9份陽性樣本。對差異樣本進(jìn)行測序驗證，結(jié)果顯示博清生物熒光定量PCR儀檢測出的那份額外陽性樣本確實含有大腸桿菌，常規(guī)PCR法因電泳檢測的局限性，未能準(zhǔn)確分辨出該樣本中的微量大腸桿菌。這充分體現(xiàn)了博清生物熒光定量PCR儀不僅檢測速度快，而且在準(zhǔn)確性上也更勝一籌，能夠更精準(zhǔn)地檢測出乳制品中的大腸桿菌污染，為乳制品生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制提供有力支持。

3、果蔬檢測：在對一批進(jìn)口草莓進(jìn)行李斯特菌檢測時，對比了博清生物熒光定量PCR儀和傳統(tǒng)檢測方法。傳統(tǒng)檢測方法包括樣本增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等，整個流程需要5-7天 。博清生物熒光定量PCR儀檢測從采樣到出結(jié)果僅需4-6小時 。檢測的80份草莓樣本中，傳統(tǒng)方法檢測出3份陽性樣本，博清生物熒光定量PCR儀檢測出4份陽性樣本。經(jīng)進(jìn)一步檢測確認(rèn)，博清生物熒光定量PCR儀檢測出的那份多出來的陽性樣本中確實存在李斯特菌，只是含量較低，傳統(tǒng)方法由于檢測周期長、靈敏度有限，未能及時發(fā)現(xiàn)。這再次證明了博清生物熒光定量PCR儀在果蔬檢測中的優(yōu)勢，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出李斯特菌，防止受污染的果蔬流入市場，保障消費者的健康。

三、應(yīng)用前景與展望

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在食品安全與檢疫領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。隨著人們對食品安全重視程度的不斷提高，以及相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的日益嚴(yán)格，對快速、準(zhǔn)確的微生物檢測技術(shù)的需求持續(xù)增長。博清生物熒光定量PCR儀憑借其卓越的性能，能夠滿足這一需求，在食品生產(chǎn)企業(yè)、監(jiān)管部門、第三方檢測機(jī)構(gòu)等得到更廣泛的應(yīng)用。在食品生產(chǎn)企業(yè)中，可用于原材料和成品的日常檢測，及時發(fā)現(xiàn)微生物污染，避免不合格產(chǎn)品流入市場，保障企業(yè)的聲譽(yù)和消費者的健康。監(jiān)管部門利用該儀器，能更高效地對市場上的食品進(jìn)行抽檢，加強(qiáng)食品安全監(jiān)管力度，維護(hù)市場秩序。第三方檢測機(jī)構(gòu)借助其優(yōu)勢，為客戶提供更優(yōu)質(zhì)、快速的檢測服務(wù)，增強(qiáng)市場競爭力。

從技術(shù)發(fā)展方向來看，未來博清生物熒光定量PCR儀可能會朝著更高通量、更小型化和自動化的方向發(fā)展。高通量檢測能夠一次處理更多的樣本，進(jìn)一步提高檢測效率，滿足大規(guī)模檢測的需求。例如，開發(fā)更高孔數(shù)的反應(yīng)板，如384孔板，可同時對更多樣本進(jìn)行檢測，在應(yīng)對突發(fā)食品安全事件時，能夠快速對大量樣本進(jìn)行篩查。小型化則使儀器便于攜帶，可用于現(xiàn)場檢測，如在農(nóng)產(chǎn)品種植基地、食品加工車間、農(nóng)貿(mào)市場等場所，及時對食品進(jìn)行檢測，減少樣本運(yùn)輸和保存過程中的風(fēng)險。自動化程度的提高，可實現(xiàn)從樣本處理到結(jié)果分析的全流程自動化，減少人工操作誤差，提高檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，同時也能降低對專業(yè)技術(shù)人員的依賴，使檢測工作更加便捷高效。

在應(yīng)用拓展方面，除了現(xiàn)有的微生物檢測，博清生物熒光定量PCR儀還有望在轉(zhuǎn)基因食品檢測、食品溯源等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因食品的安全性和標(biāo)識問題備受關(guān)注。熒光定量PCR儀能夠準(zhǔn)確檢測食品中的轉(zhuǎn)基因成分，并對其含量進(jìn)行定量分析，為監(jiān)管部門和消費者提供重要信息。在食品溯源方面，通過檢測食品中的微生物DNA或其他特征性核酸序列，結(jié)合大數(shù)據(jù)和區(qū)塊鏈技術(shù)，可建立食品從生產(chǎn)到銷售的全鏈條溯源體系，一旦發(fā)生食品安全問題，能夠快速準(zhǔn)確地追溯到問題源頭，采取相應(yīng)措施，降低食品安全風(fēng)險。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀作為一種先進(jìn)的檢測設(shè)備，在食品安全與檢疫領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和應(yīng)用的不斷拓展，它將為保障食品安全、維護(hù)公眾健康做出更大的貢獻(xiàn)。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在食品安全與檢疫的微生物快速檢測中具有不可替代的重要作用。面對常見且危害巨大的食源性致病菌，如沙門氏菌、大腸桿菌和李斯特菌等，傳統(tǒng)檢測方法存在諸多局限性，而博清生物熒光定量PCR儀基于先進(jìn)的技術(shù)原理，具備準(zhǔn)確性高、靈敏度高、速度快和特異性強(qiáng)等顯著特點。

通過肉類、乳制品和果蔬檢測等實際案例分析，充分驗證了其在縮短檢測時間、提高檢測準(zhǔn)確性和靈敏度方面的優(yōu)勢，能夠及時發(fā)現(xiàn)低濃度微生物污染，有效避免受污染食品流入市場，保障消費者健康。與其他品牌熒光定量PCR儀相比，博清生物產(chǎn)品在準(zhǔn)確性、靈敏度、檢測速度、價格以及售后服務(wù)等方面均展現(xiàn)出明顯的競爭優(yōu)勢。

展望未來，隨著人們對食品安全重視程度的不斷提升以及相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的日益嚴(yán)格，博清生物熒光定量PCR儀有望在食品生產(chǎn)企業(yè)、監(jiān)管部門、第三方檢測機(jī)構(gòu)等得到更廣泛的應(yīng)用。同時，其在技術(shù)上朝著更高通量、更小型化和自動化方向發(fā)展，在應(yīng)用領(lǐng)域向轉(zhuǎn)基因食品檢測、食品溯源等方向拓展，將為食品安全與檢疫工作提供更強(qiáng)大的技術(shù)支持，對保障食品安全和公共健康具有極其重要的意義。