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一、研究背景

制藥與生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中，生物反應(yīng)器的發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝及目的產(chǎn)物合成受溫度、pH、溶解氧（DO）、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度等多重因素調(diào)控。傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法（如離線取樣結(jié)合HPLC、細(xì)胞計(jì)數(shù)板）存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、樣本消耗量高、操作繁瑣等缺陷，難以實(shí)時(shí)反映發(fā)酵體系的動(dòng)態(tài)變化，易導(dǎo)致工藝參數(shù)失控，影響產(chǎn)品收率與質(zhì)量一致性。因此，開(kāi)發(fā)高通量、快速、精準(zhǔn)的監(jiān)測(cè)技術(shù)成為產(chǎn)業(yè)迫切需求。

酶標(biāo)儀作為基于抗原-抗體特異性結(jié)合、酶促反應(yīng)顯色原理的分析儀器，具有檢測(cè)速度快、樣本需求量少、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀在傳統(tǒng)酶標(biāo)儀基礎(chǔ)上優(yōu)化了光學(xué)系統(tǒng)與檢測(cè)算法，具備微孔板高通量分析及數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)導(dǎo)出功能，但其在生物反應(yīng)器工業(yè)級(jí)監(jiān)測(cè)中的系統(tǒng)性應(yīng)用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1、核心儀器：博清生物酶標(biāo)儀；對(duì)照儀器：自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。

2、試劑：細(xì)胞密度檢測(cè)試劑盒、葡萄糖/乳酸檢測(cè)試劑盒、谷氨酰胺/谷氨酸檢測(cè)試劑盒、單克隆抗體檢測(cè)試劑盒；CHO-K1細(xì)胞、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清；發(fā)酵液常見(jiàn)雜質(zhì)。

（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、檢測(cè)方法建立

細(xì)胞密度（CD）：采用MTT法，取發(fā)酵液樣本10μL，與90μL MTT工作液混合，37℃孵育4h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處吸光度（OD570），建立OD值與細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

代謝產(chǎn)物（Glc、Lac、Gln、Glu）：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別檢測(cè)505nm（Glc）、570nm（Lac）、340nm（Gln/Glu）處吸光度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

目的蛋白（抗PD-1單抗）：采用間接ELISA法，包被抗原（PD-1蛋白），加入稀釋后的發(fā)酵液樣本，二抗標(biāo)記HRP，TMB顯色后檢測(cè)450nm處吸光度，定量蛋白濃度。

2、方法學(xué)驗(yàn)證

線性范圍：配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品（CD：1×103~1×10?cells/mL；Glc：0~50mmol/L；Lac：0~30mmol/L；Gln：0~10mmol/L；Glu：0~5mmol/L；單抗：0~100μg/mL），檢測(cè)吸光度并進(jìn)行線性回歸分析。

精密度：同一批次樣本重復(fù)檢測(cè)6次（批內(nèi)精密度），連續(xù)3天檢測(cè)同一批次樣本（批間精密度），計(jì)算變異系數(shù)（CV）。

準(zhǔn)確度：向已知濃度的發(fā)酵液樣本中加入不同比例標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算回收率。

特異性：向樣本中加入發(fā)酵液常見(jiàn)雜質(zhì)（終濃度：蔗糖50g/L、甘油20g/L、吐溫80 1 g/L），檢測(cè)吸光度變化率。

3、實(shí)際發(fā)酵工藝監(jiān)測(cè)

采用CHO-K1細(xì)胞表達(dá)抗PD-1單抗，5L生物反應(yīng)器發(fā)酵14天，分別于0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288h取樣，使用博清生物酶標(biāo)儀與對(duì)照儀器同步檢測(cè)各指標(biāo)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果一致性及動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。

三、結(jié)果與分析

（一）方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

1、線性范圍

博清生物酶標(biāo)儀檢測(cè)各指標(biāo)的線性范圍及相關(guān)系數(shù)顯示，所有指標(biāo)的R2均≥0.995，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，可覆蓋生物反應(yīng)器發(fā)酵過(guò)程中各指標(biāo)的濃度變化范圍。

2、精密度與準(zhǔn)確度

批內(nèi)與批間精密度結(jié)果顯示，各指標(biāo)CV值均≤3.2%，表明儀器檢測(cè)重復(fù)性良好；回收率在95.8%~103.6%之間，符合生物檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度要求（回收率 90%~110%）。

3、特異性

添加發(fā)酵液常見(jiàn)雜質(zhì)后，各指標(biāo)吸光度變化率均≤2.5%，表明博清生物酶標(biāo)儀檢測(cè)不受雜質(zhì)干擾，特異性良好。

（二）實(shí)際發(fā)酵工藝監(jiān)測(cè)結(jié)果

1、檢測(cè)結(jié)果一致性

博清生物酶標(biāo)儀與對(duì)照儀器（細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、HPLC）檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析顯示，各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)均≥0.990，表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果高度一致，博清生物酶標(biāo)儀可替代傳統(tǒng)方法用于實(shí)際發(fā)酵監(jiān)測(cè)。

2、發(fā)酵過(guò)程動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

CHO-K1細(xì)胞發(fā)酵14天的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：細(xì)胞密度在0~72h快速增長(zhǎng)，72h達(dá)到峰值（8.6×10?cells/mL），隨后進(jìn)入穩(wěn)定期；葡萄糖濃度隨細(xì)胞生長(zhǎng)持續(xù)下降，72h后降至5mmol/L以下；乳酸濃度在48h達(dá)到峰值（22.3mmol/L），隨后緩慢下降；谷氨酰胺濃度在96h耗盡，谷氨酸濃度同步升高；抗PD-1單抗?jié)舛仍?2h后開(kāi)始顯著上升，288h達(dá)到最高值（89.6 μg/mL）。博清生物酶標(biāo)儀可實(shí)時(shí)捕捉上述動(dòng)態(tài)變化，為工藝參數(shù)調(diào)整（如補(bǔ)料時(shí)機(jī)、DO調(diào)控）提供精準(zhǔn)數(shù)據(jù)支持。

  3、檢測(cè)效率對(duì)比

與傳統(tǒng)方法相比，博清生物酶標(biāo)儀的檢測(cè)效率顯著提升：?jiǎn)螛颖緳z測(cè)時(shí)間從HPLC的30~60min、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的10min 縮短至5min以內(nèi)；96孔板高通量檢測(cè)可同時(shí)處理80個(gè)以上樣本，單日檢測(cè)量提升40%；樣本消耗量從HPLC的500μL、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的20μL減少至10μL，樣本損耗降低80%。

四、討論

生物反應(yīng)器監(jiān)測(cè)的核心需求是“實(shí)時(shí)、精準(zhǔn)、高效”，這直接影響發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性與產(chǎn)品質(zhì)量。本研究中，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀通過(guò)優(yōu)化的光學(xué)系統(tǒng)與特異性檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞密度、代謝產(chǎn)物及目的蛋白的一體化監(jiān)測(cè)，其方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，表明儀器具備工業(yè)級(jí)應(yīng)用的可靠性。

與傳統(tǒng)方法相比，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀的核心優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在三方面：（1）高通量與低成本：96孔板設(shè)計(jì)適配規(guī)?；a(chǎn)的批量檢測(cè)需求，樣本消耗量減少80%，降低試劑成本與廢液處理壓力；（2）實(shí)時(shí)性與便捷性：檢測(cè)周期縮短至5min以內(nèi)，數(shù)據(jù)可實(shí)時(shí)導(dǎo)出至工藝控制系統(tǒng)，支持動(dòng)態(tài)調(diào)整補(bǔ)料策略與環(huán)境參數(shù)，減少工藝波動(dòng)；（3）特異性與抗干擾能力：針對(duì)發(fā)酵液復(fù)雜基質(zhì)優(yōu)化的檢測(cè)方法，可有效規(guī)避蔗糖、甘油等雜質(zhì)的干擾，保障檢測(cè)準(zhǔn)確性。

在實(shí)際發(fā)酵監(jiān)測(cè)中，博清生物酶標(biāo)儀成功捕捉了CHO-K1細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝及單抗合成的動(dòng)態(tài)規(guī)律：72h細(xì)胞密度峰值與葡萄糖耗盡時(shí)機(jī)的同步性，提示需在48~72h進(jìn)行葡萄糖補(bǔ)料；乳酸濃度在48h后的下降趨勢(shì)，反映細(xì)胞代謝模式從糖酵解向氧化磷酸化轉(zhuǎn)變；谷氨酰胺耗盡與谷氨酸積累的相關(guān)性，為谷氨酰胺補(bǔ)料策略提供依據(jù)。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了儀器在工藝優(yōu)化中的實(shí)用價(jià)值，可幫助企業(yè)提升產(chǎn)品收率與質(zhì)量一致性。

本研究的局限性在于未探究極端發(fā)酵條件（如高鹽、高黏度發(fā)酵液）對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，未來(lái)可進(jìn)一步拓展儀器在特殊工藝（如連續(xù)流發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵）中的應(yīng)用研究；同時(shí)，結(jié)合物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)酶標(biāo)儀與生物反應(yīng)器的在線聯(lián)動(dòng)，構(gòu)建智能化監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，將是后續(xù)研究的重點(diǎn)方向。

本研究建立了博清生物酶標(biāo)儀檢測(cè)生物反應(yīng)器關(guān)鍵指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證與實(shí)際發(fā)酵工藝監(jiān)測(cè)，證實(shí)該儀器具有線性范圍寬、精密度高、準(zhǔn)確度好、特異性強(qiáng)及檢測(cè)效率高等優(yōu)勢(shì)，可有效替代傳統(tǒng)檢測(cè)方法用于細(xì)胞密度、代謝產(chǎn)物及目的蛋白的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀的應(yīng)用不僅降低了制藥與生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的監(jiān)測(cè)成本，提升了工藝控制精度，還為發(fā)酵過(guò)程的智能化升級(jí)提供了核心技術(shù)工具，具有重要的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值與推廣前景。