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一、研究背景

畜禽疫?。ㄈ绶侵挢i瘟、禽流感、藍耳病等）具有傳播速度快、致死率高、經(jīng)濟損失大等特點，嚴重威脅畜牧業(yè)安全生產(chǎn)與公共衛(wèi)生安全。傳統(tǒng)診斷方法中，病毒分離培養(yǎng)操作復雜、耗時久（2-7天），難以滿足疫情應(yīng)急處置需求；膠體金免疫層析法雖快速簡便，但靈敏度較低，易出現(xiàn)漏檢；實時熒光定量PCR（qPCR）靈敏度與特異性較高，但依賴專業(yè)實驗室與操作人員，設(shè)備成本高，不適用于基層現(xiàn)場檢測。因此，開發(fā)兼具高靈敏度、高特異性與便攜性的快速診斷技術(shù)，成為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光計基于先進的生物熒光檢測技術(shù)，整合微型光學系統(tǒng)、恒溫擴增模塊與智能數(shù)據(jù)分析模塊，可實現(xiàn)病原體核酸或抗原的快速定量檢測。

二、材料與方法

（一）實驗材料

1、儀器設(shè)備：博清生物熒光計；實時熒光定量PCR儀；膠體金檢測試劑盒；高速冷凍離心機。

2、試劑與樣本：目標病原體標準品；非目標病原體（豬瘟病毒、新城疫病毒等5種）；臨床樣本共362份（包括豬血清186份、雞咽拭子124份、豬組織勻漿52份，采集某規(guī)?；B(yǎng)殖場）；熒光探針（特異性針對目標病原體基因保守區(qū)）；恒溫擴增試劑。

（二）檢測原理

博清生物熒光計采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，當特異性熒光探針與目標病原體核酸（或抗原）結(jié)合后，探針構(gòu)象發(fā)生改變，激發(fā)光能量從供體熒光基團轉(zhuǎn)移至受體熒光基團，產(chǎn)生特異性熒光信號。儀器通過微型光學傳感器捕捉熒光強度變化，結(jié)合內(nèi)置標準曲線，實現(xiàn)目標病原體的定量檢測，檢測結(jié)果以“陽性/陰性”及核酸拷貝數(shù)呈現(xiàn)。

（三）實驗方法

1、樣本處理

血清樣本室溫靜置30min后，8000r/min離心5min取上清；組織勻漿樣本按1:5比例加入生理鹽水研磨，10000r/min離心10min取上清；咽拭子樣本置于含3mL PBS緩沖液的離心管中，振蕩10min后取上清。所有樣本均采用核酸提取試劑盒（磁珠法）提取核酸，操作按試劑盒說明書進行。

2、檢測體系優(yōu)化

以ASFV為模型，優(yōu)化熒光探針濃度（0.2-1.0μmol/L）、擴增溫度（60-65℃）、反應(yīng)時間（20-40min）等參數(shù)，以熒光信號強度、檢測限為評價指標，確定最佳反應(yīng)條件。

3、性能評價實驗

靈敏度檢測：將目標病原體標準品進行10倍梯度稀釋（10?-10?copies/μL），分別采用博清生物熒光計、qPCR儀、膠體金試劑盒進行檢測，記錄最低檢測限。

特異性檢測：采用優(yōu)化后的檢測體系，對5種非目標病原體及3種目標病原體進行檢測，驗證儀器特異性。

檢測速度對比：統(tǒng)計3種方法從樣本處理到獲得結(jié)果的總時間。

臨床樣本驗證：采用3種方法對362份臨床樣本進行平行檢測，以qPCR檢測結(jié)果為金標準，計算博清生物熒光計的檢測符合率、靈敏度、特異度。

三、結(jié)果與分析

（一）檢測體系優(yōu)化結(jié)果

當熒光探針濃度為0.6μmol/L、擴增溫度為63℃、反應(yīng)時間為30min時，博清生物熒光計對ASFV標準品的熒光信號強度最高，背景噪音最低，確定為最佳反應(yīng)條件。

（二）靈敏度檢測結(jié)果---

博清生物熒光計對ASFV、AIV-H9、PRRSV的最低檢測限均為101copies/μL，qPCR儀檢測限為10?copies/μL，膠體金試劑盒檢測限為103copies/μL。博清生物熒光計靈敏度雖略低于qPCR，但較膠體金方法提升100倍。

（三）特異性檢測結(jié)果---

博清生物熒光計僅對ASFV、AIV-H9、PRRSV產(chǎn)生特異性熒光信號，與豬瘟病毒、新城疫病毒等5種非目標病原體無交叉反應(yīng)，特異性達100%，與qPCR檢測結(jié)果一致。

（四）檢測速度對比結(jié)果---

博清生物熒光計單個樣本從處理到出結(jié)果的總時間為35min，其中樣本處理15min、擴增檢測20min；qPCR總時間為90min（樣本處理30min、擴增檢測60min）；膠體金總時間為25min，但需手動判讀結(jié)果，主觀性較強。

（五）臨床樣本驗證結(jié)果

362份臨床樣本中，qPCR檢測陽性128份、陰性234份。博清生物熒光計檢測陽性126份、陰性236份，與qPCR檢測結(jié)果的總符合率為98.2%（356/362），靈敏度為98.4%（126/128），特異度為98.3%（230/234），與膠體金方法（符合率91.7%）相比差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=18.36，P<0.01）。

四、討論

本研究構(gòu)建的博清生物熒光計畜禽疫病檢測體系，通過優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，實現(xiàn)了對ASFV、AIV-H9、PRRSV等常見疫病的快速精準檢測。結(jié)果顯示，該儀器靈敏度較膠體金方法大幅提升，接近qPCR水平，可有效減少漏檢風險；特異性達100%，避免了交叉反應(yīng)導致的誤判，為疫情精準防控提供可靠依據(jù)。

在檢測效率方面，博清生物熒光計將單個樣本檢測周期控制在35min內(nèi)，較傳統(tǒng)qPCR縮短60%以上，且無需專業(yè)實驗室環(huán)境，儀器重量僅0.5kg，配備觸摸屏操作界面與藍牙數(shù)據(jù)傳輸功能，適合養(yǎng)殖場現(xiàn)場快速篩查與基層防疫部門移動檢測。此外，該儀器采用一次性反應(yīng)芯片，避免交叉污染，檢測成本僅為qPCR的1/3，符合規(guī)?；B(yǎng)殖與基層防疫的成本控制需求。

與現(xiàn)有研究相比，本研究首次系統(tǒng)驗證了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光計在多種畜禽疫病診斷中的應(yīng)用性能，覆蓋豬、禽等主要養(yǎng)殖品種，臨床樣本量較大，結(jié)果可靠性更高。但本研究僅針對3種常見疫病，后續(xù)可擴展至牛、羊等畜禽疫病檢測，進一步優(yōu)化多通道檢測模塊，實現(xiàn)多種病原體的同步篩查。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光計憑借高靈敏度、高特異性、快速便捷、成本可控等優(yōu)勢，在畜禽疫病診斷中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。該儀器可有效解決傳統(tǒng)診斷方法在基層應(yīng)用中的痛點，為畜牧業(yè)疫病早發(fā)現(xiàn)、早處置提供技術(shù)支撐，對保障畜牧業(yè)健康發(fā)展與公共衛(wèi)生安全具有重要意義。未來可通過技術(shù)迭代，進一步提升多病原體同步檢測能力，拓展在畜禽疫病流行病學調(diào)查中的應(yīng)用場景。