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移液器作為實驗室核心移液工具，其性能參數(shù)（如精度、重復(fù)性、量程適配性）與操作體驗（如活塞阻力、吸液穩(wěn)定性）對實驗結(jié)果至關(guān)重要。傳統(tǒng)移液器在微量移液（≤10μL）時易出現(xiàn)液體殘留、移液偏差較大等問題，尤其在單細胞分離等對操作精準度要求極高的場景中，常導(dǎo)致目標細胞丟失或非目標細胞污染。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的單道移液器針對微量操作場景優(yōu)化設(shè)計，采用高精度活塞與防腐蝕密封結(jié)構(gòu)，搭載自適應(yīng)量程校準技術(shù)，具備更優(yōu)的移液精度和重復(fù)性。

一、材料與方法

（一）實驗儀器與試劑

1、核心儀器：博清生物單道移液器；流式細胞分選儀；微量核酸提取試劑盒；實時熒光定量PCR儀；生物分析儀。

2、實驗試劑：DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；PBS緩沖液；RNA酶抑制劑；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；qPCR混合液；β-actin引物。

3、細胞樣本：人乳腺癌MCF-7細胞系。

（二）移液器性能基礎(chǔ)驗證

1、移液精度與重復(fù)性檢測

參照相應(yīng)標準，選取3個關(guān)鍵量程（1μL、10μL、100μL），采用去離子水為樣品，在25℃、濕度50%環(huán)境下，每個量程重復(fù)移液10次，通過電子天平稱重計算實際移液體積，統(tǒng)計均值、標準差（SD）及變異系數(shù)（CV），驗證精度（實際體積與設(shè)定體積偏差）和重復(fù)性（CV值）。同時以某品牌移液器作為對照。

2、液體殘留檢測

選取10μL量程，移取0.1%亞甲基藍溶液，將液體完全排出后，用50μL無水乙醇沖洗吸頭內(nèi)部，通過紫外分光光度計檢測沖洗液中染料吸光度，計算殘留率。

（三）單細胞分離實驗

1、細胞預(yù)處理

MCF-7細胞常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化后用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度至1×10?cells/mL，經(jīng)40μm細胞篩過濾去除聚集體。

2、單細胞分選與捕獲

采用流式細胞分選儀標記CD44?目標細胞，通過博清生物單道移液器（10μL量程）將分選后的單細胞逐一轉(zhuǎn)移至96孔板（每孔含10μL含RNA酶抑制劑的裂解液）。操作過程中控制吸液速度為2檔、排液速度為1檔，避免液體飛濺。同時使用對照移液器進行平行實驗，每組設(shè)置3個復(fù)孔，每孔計數(shù)目標細胞捕獲數(shù)量，計算捕獲成功率。

（四）微量RNA提取與質(zhì)量檢測

采用微量核酸提取試劑盒對捕獲的單細胞進行RNA提取，全程使用博清生物單道移液器（1-10μL量程）進行試劑添加、液體轉(zhuǎn)移等操作。提取完成后，通過生物分析儀檢測RNA完整性數(shù)（RIN），并采用紫外分光光度計檢測A260/A280比值（1.8-2.0為合格）。

（五）qPCR驗證實驗

1、cDNA合成

取1μL單細胞RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系總體積10μL，使用博清生物單道移液器精準添加引物、酶、緩沖液等試劑，反應(yīng)條件：25℃ 10min，50℃ 30min，85℃ 5min。

2、qPCR擴增

以β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)計特異性引物。qPCR反應(yīng)體系20μL，其中cDNA模板2μL，使用博清生物單道移液器精準分配反應(yīng)液至384孔板，每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。擴增條件：95℃ 10min，隨后95℃ 15s、60℃ 1min，40個循環(huán)。記錄Ct值，計算變異系數(shù)。

二、結(jié)果

（一）移液器基礎(chǔ)性能驗證結(jié)果

博清生物單道移液器在不同量程下的移液精度與重復(fù)性均表現(xiàn)優(yōu)異，且顯著優(yōu)于對照移液器（P<0.05）。1μL量程下，博清移液器實際移液體積均值為0.98±0.01μL，CV值為0.82%，而對照移液器實際體積為0.92±0.03μL，CV值為3.26%；10μL和100μL量程下，博清生物移液器CV值分別為0.57%和0.31%，均低于對照移液器。液體殘留檢測顯示，博清生物移液器殘留率為0.32%±0.05%，顯著低于對照移液器的1.21%±0.13%（P<0.01）。

（二）單細胞捕獲成功率

博清生物單道移液器組的單細胞捕獲成功率為92.3%±2.1%，顯著高于對照移液器組的81.7%±3.5%（t=4.62，P<0.01）。鏡檢結(jié)果顯示，博清生物移液器組96孔板中單個細胞孔占比達90.5%，無細胞孔占比6.3%，多細胞孔占比3.2%；而對照移液器組單個細胞孔占比78.1%，無細胞孔占比12.5%，多細胞孔占比9.4%。

（三）RNA提取質(zhì)量

博清移液器組提取的單細胞RNA樣本RIN均值為8.6±0.3，A260/A280比值為1.92±0.05，均滿足scRNA-seq建庫對RNA質(zhì)量的要求（RIN≥7.0）；對照移液器組RIN均值為7.8±0.5，A260/A280比值為1.85±0.08，兩組RIN值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.87，P<0.05）。

（四）qPCR實驗結(jié)果

博清生物移液器組β-actin基因Ct值為28.3±0.4，CV值為1.41%；對照移液器組Ct值為29.1±0.8，CV值為2.75%。兩組Ct值CV值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.95，P<0.05），表明博清生物移液器組實驗重復(fù)性更優(yōu)。

三、討論

單細胞研究的核心挑戰(zhàn)之一是如何在微量操作中維持細胞完整性與核酸穩(wěn)定性，而移液器的性能直接決定了實驗流程的可控性。本研究針對博清生物單道移液器的核心性能及在單細胞研究中的應(yīng)用場景進行系統(tǒng)驗證，結(jié)果表明該儀器在多個關(guān)鍵指標上表現(xiàn)突出。

在基礎(chǔ)性能方面，博清生物單道移液器通過優(yōu)化活塞結(jié)構(gòu)與密封技術(shù)，實現(xiàn)了全量程范圍內(nèi)的高精準度與強重復(fù)性，1μL微量移液時CV值僅0.82%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)移液器，這一優(yōu)勢在單細胞分離等需要精準轉(zhuǎn)移微量液體的場景中尤為重要。液體殘留率低（0.32%）的特點可減少試劑浪費與交叉污染，降低后續(xù)核酸檢測的背景干擾，這與該儀器采用的防殘留吸頭適配設(shè)計密切相關(guān)。

在單細胞捕獲實驗中，博清生物移液器92.3%的捕獲成功率顯著高于對照儀器，這得益于其平穩(wěn)的吸液/排液控制與精準的量程校準。單細胞分離過程中，吸液速度過快易導(dǎo)致細胞損傷，排液不完全則會造成細胞丟失，而博清生物移液器的多檔速度調(diào)節(jié)功能與高密封性能有效解決了這一問題，減少了無細胞孔和多細胞孔的比例，為后續(xù)單細胞分析提供了高質(zhì)量的樣品基礎(chǔ)。

RNA質(zhì)量是單細胞測序成功的關(guān)鍵，本研究中博清生物移液器組提取的RNA RIN均值達8.6，表明其在微量試劑添加、液體轉(zhuǎn)移過程中能有效保護RNA完整性，避免因操作不當(dāng)導(dǎo)致的核酸降解。這一結(jié)果與該儀器的低液體殘留特性相關(guān)，減少了RNA酶污染的風(fēng)險，同時精準的移液操作確保了提取試劑比例的準確性，提升了核酸提取效率。

qPCR驗證實驗中，博清生物移液器組Ct值CV值僅1.41%，體現(xiàn)了其在高通量檢測中的優(yōu)異重復(fù)性。在單細胞qPCR等對反應(yīng)體系均一性要求極高的實驗中，移液偏差會導(dǎo)致Ct值離散度增大，影響基因表達定量的可靠性，而博清生物移液器的高重復(fù)性可有效降低實驗誤差，提升數(shù)據(jù)可信度。

綜上，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的單道移液器通過在精準度、重復(fù)性、防殘留等方面的技術(shù)優(yōu)化，能夠完美適配單細胞研究中的微量操作需求，從單細胞分離、核酸提取到后續(xù)檢測的全流程提供穩(wěn)定支撐。與傳統(tǒng)移液器相比，其在提升實驗效率、保障數(shù)據(jù)質(zhì)量方面具有顯著優(yōu)勢，有望成為單細胞生物學(xué)、精準醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的理想實驗工具。

本研究系統(tǒng)驗證了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的單道移液器在單細胞研究中的應(yīng)用性能，證實該儀器具有高移液精度、強重復(fù)性、低液體殘留等核心優(yōu)勢，可有效提升單細胞捕獲成功率、保障RNA完整性及qPCR檢測重復(fù)性，滿足單細胞分離、微量核酸分析等關(guān)鍵實驗環(huán)節(jié)的技術(shù)要求。博清生物單道移液器憑借其優(yōu)異的性能與良好的操作適配性，為單細胞研究提供了穩(wěn)定可靠的工具支持，具有廣闊的科研應(yīng)用前景。