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病毒感染性疾病具有傳播速度快、影響范圍廣、致病機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)，及時(shí)準(zhǔn)確的診斷是防控疫情蔓延、指導(dǎo)臨床治療的關(guān)鍵。核酸檢測(cè)憑借高特異性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，已成為病毒感染診斷的核心技術(shù)，其流程主要包括核酸提取、擴(kuò)增反應(yīng)及結(jié)果分析三大環(huán)節(jié)。其中，核酸提取是去除樣本中蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等雜質(zhì)，分離純化目標(biāo)核酸的關(guān)鍵步驟，提取效果直接影響后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和靈敏度，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、病毒樣本：選取常見(jiàn)RNA病毒（新型冠狀病毒、甲型流感病毒H1N1亞型）和DNA病毒（人乳頭瘤病毒HPV16型、EB病毒）的標(biāo)準(zhǔn)品及臨床樣本。其中包括咽拭子、鼻咽拭子及血液樣本共200份。

2、主要儀器：博清生物核酸提取儀、同類商業(yè)化核酸提取儀（對(duì)照儀器A、對(duì)照儀器B）、熒光定量PCR儀、超微量紫外分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)。

3、試劑：磁珠法核酸提取試劑盒、對(duì)照儀器專用提取試劑盒、熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（針對(duì)各病毒特異性基因設(shè)計(jì)引物和探針）、無(wú)水乙醇、Tris-HCl緩沖液等，均為分析純或生化試劑級(jí)。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、樣本處理：將病毒標(biāo)準(zhǔn)品用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋（10^1-10^6copies/mL），臨床樣本按照常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理，咽拭子和鼻咽拭子樣本加入采樣管中，充分振蕩后取上清液；血液樣本經(jīng)離心分離血清后備用。

2、核酸提?。悍謩e采用博清生物核酸提取儀、傳統(tǒng)手工提取法及對(duì)照儀器A、對(duì)照儀器B對(duì)上述樣本進(jìn)行核酸提取，具體操作按照各儀器及試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。博清生物核酸提取儀的提取流程包括：樣本加樣、裂解液添加、磁珠結(jié)合、洗滌、洗脫等步驟，全程自動(dòng)化完成，單次提取時(shí)間設(shè)置為30分鐘，同時(shí)處理16份樣本。

3、核酸純度與濃度檢測(cè)：采用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取核酸的A260/A280比值（評(píng)估核酸純度）和A260值（計(jì)算核酸濃度），每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

4、核酸回收率計(jì)算：根據(jù)病毒標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度和提取后核酸濃度，計(jì)算各方法的核酸回收率，回收率=（提取后核酸總量/初始核酸總量）×100%。

5、熒光定量PCR檢測(cè)：將提取的核酸樣本進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL，包括PCR緩沖液、引物、探針、Taq酶及模板核酸，反應(yīng)條件按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置。以Ct值（循環(huán)閾值）作為檢測(cè)指標(biāo)，Ct值越小表示檢測(cè)靈敏度越高，以Ct值≤38為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

6、穩(wěn)定性評(píng)估：選取10^3copies/mL 的病毒標(biāo)準(zhǔn)品，采用博清生物核酸提取儀進(jìn)行10次批內(nèi)重復(fù)提取和5次批間重復(fù)提取，通過(guò)計(jì)算核酸濃度和Ct值的變異系數(shù)（CV）評(píng)估儀器的穩(wěn)定性。

二、結(jié)果

（一）核酸純度與濃度比較

超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，博清生物核酸提取儀提取的RNA病毒核酸A260/A280比值為1.85±0.06，DNA病毒核酸A260/A280比值為1.92±0.05，均處于1.8-2.0的理想范圍，表明提取的核酸純度較高，蛋白質(zhì)污染較少；傳統(tǒng)手工提取法的RNA病毒核酸A260/A280比值為1.72±0.11，DNA病毒核酸為1.78±0.09，顯著低于博清生物核酸提取儀（P<0.05）；對(duì)照儀器A和對(duì)照儀器B的核酸純度與博清生物核酸提取儀無(wú)顯著差異（P>0.05）。

（二）核酸回收率分析

對(duì)于RNA病毒標(biāo)準(zhǔn)品，博清生物核酸提取儀的核酸回收率為（89.6±4.2）%，傳統(tǒng)手工提取法為（66.3±5.1）%，對(duì)照儀器A為（85.3±4.5）%，對(duì)照儀器B為（83.7±4.8）%；博清生物核酸提取儀的回收率顯著高于傳統(tǒng)手工提取法和對(duì)照儀器B（P<0.05），與對(duì)照儀器A無(wú)顯著差異（P>0.05）。

對(duì)于DNA病毒標(biāo)準(zhǔn)品，博清生物核酸提取儀的核酸回收率為（91.2±3.8）%，傳統(tǒng)手工提取法為（70.5±4.6）%，對(duì)照儀器A為（87.5±4.1）%，對(duì)照儀器B為（86.2±4.3）%；同樣，博清生物核酸提取儀的回收率顯著高于傳統(tǒng)手工提取法（P<0.05），與對(duì)照儀器A、B無(wú)顯著差異（P>0.05）。

（三）檢測(cè)靈敏度對(duì)比

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，博清生物核酸提取儀提取的RNA病毒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢出濃度為10^1copies/mL，對(duì)應(yīng)的Ct值為36.8±0.5；傳統(tǒng)手工提取法的最低檢出濃度為10^2copies/mL，Ct值為37.2±0.6；對(duì)照儀器A的最低檢出濃度為10^1copies/mL，Ct值為37.5±0.4；對(duì)照儀器B的最低檢出濃度為10^1copies/mL，Ct值為37.8±0.5。

對(duì)于DNA病毒標(biāo)準(zhǔn)品，博清生物核酸提取儀的最低檢出濃度為10^1copies/mL，Ct值為36.5±0.3；傳統(tǒng)手工提取法為10^2copies/mL，Ct值為37.0±0.4；對(duì)照儀器A和B的最低檢出濃度均為10^1copies/mL，Ct值分別為37.1±0.3和37.3±0.4。統(tǒng)計(jì)分析表明，博清生物核酸提取儀的檢測(cè)靈敏度顯著高于傳統(tǒng)手工提取法（P<0.05），與對(duì)照儀器A、B無(wú)顯著差異（P>0.05），但在相同濃度下，博清生物核酸提取儀的Ct值更低，表明其提取的核酸模板質(zhì)量更優(yōu)。

（四）穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果

批內(nèi)穩(wěn)定性測(cè)試中，博清生物核酸提取儀提取的病毒核酸濃度CV值為1.8%，Ct值CV值為2.1%；批間穩(wěn)定性測(cè)試中，核酸濃度CV值為3.2%，Ct值CV值為3.5%，均顯著低于傳統(tǒng)手工提取法（批內(nèi)CV值：核酸濃度4.5%、Ct值3.8%；批間CV值：核酸濃度5.2%、Ct值4.7%）（P<0.05），表明博清生物核酸提取儀的操作穩(wěn)定性良好，人為誤差影響較小。

（五）臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果

200份臨床樣本經(jīng)博清生物核酸提取儀提取后，熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性86例，陽(yáng)性檢出率43.0%；對(duì)照儀器A檢測(cè)陽(yáng)性82例，陽(yáng)性檢出率41.0%；兩種儀器的檢測(cè)一致性較好（Kappa值=0.89），但博清生物核酸提取儀的陽(yáng)性檢出率略高于對(duì)照儀器A，且在低病毒載量樣本（Ct值35-38）中，博清生物核酸提取儀的檢出數(shù)（12例）多于對(duì)照儀器A（8例），表明其在臨床樣本檢測(cè)中具有更高的實(shí)用性。

三、討論

病毒感染檢測(cè)的核心在于快速、準(zhǔn)確地獲取目標(biāo)病毒核酸，而核酸提取作為檢測(cè)流程的首要環(huán)節(jié)，其技術(shù)水平直接影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。磁珠法作為目前主流的核酸提取技術(shù)，憑借特異性結(jié)合核酸、分離效率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于自動(dòng)化核酸提取儀中。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀基于磁珠法原理，通過(guò)優(yōu)化提取緩沖液配方和自動(dòng)化程序，實(shí)現(xiàn)了病毒核酸的高效提取，本研究結(jié)果充分驗(yàn)證了其技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

在核酸純度方面，博清生物核酸提取儀提取的核酸A260/A280比值均處于理想范圍，表明其能夠有效去除樣本中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，減少雜質(zhì)對(duì)后續(xù)PCR擴(kuò)增的抑制作用。傳統(tǒng)手工提取法由于操作步驟繁瑣，容易導(dǎo)致雜質(zhì)殘留，進(jìn)而影響核酸純度，這與本研究中手工提取法的核酸純度較低結(jié)果一致。在提取效率上，博清生物核酸提取儀可在30分鐘內(nèi)完成96份樣本的批量處理，顯著高于傳統(tǒng)手工提取法（單樣本提取時(shí)間約60分鐘），能夠滿足大規(guī)模樣本篩查的需求，尤其適用于疫情爆發(fā)等緊急場(chǎng)景。

核酸回收率和檢測(cè)靈敏度是評(píng)估核酸提取儀性能的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究中，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀對(duì)RNA病毒和DNA病毒的核酸回收率均顯著高于傳統(tǒng)手工提取法，且最低檢出濃度達(dá)到10^1copies/mL，與同類商業(yè)化儀器相當(dāng)甚至更優(yōu)，表明其能夠高效捕獲樣本中的低濃度病毒核酸，有效避免漏檢。此外，該儀器的批內(nèi)和批間變異系數(shù)較小，穩(wěn)定性良好，能夠減少不同操作人員、不同實(shí)驗(yàn)批次之間的誤差，保證檢測(cè)結(jié)果的一致性，這對(duì)于臨床診斷和科研數(shù)據(jù)的可靠性至關(guān)重要。

臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果顯示，博清生物核酸提取儀的陽(yáng)性檢出率略高于對(duì)照儀器A，尤其在低病毒載量樣本中表現(xiàn)更優(yōu)，這可能得益于其高效的核酸回收率和較低的雜質(zhì)殘留，使得低濃度病毒核酸能夠被有效擴(kuò)增和檢測(cè)。同時(shí)，該儀器的操作流程自動(dòng)化程度高，無(wú)需復(fù)雜的手工操作，不僅降低了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，還減少了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步提升了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

當(dāng)然，本研究也存在一定局限性，如僅針對(duì)幾種常見(jiàn)病毒進(jìn)行了驗(yàn)證，對(duì)于其他類型病毒的提取效果仍需進(jìn)一步評(píng)估；此外，樣本類型主要包括咽拭子、鼻咽拭子和血液樣本，對(duì)于痰液、糞便等復(fù)雜樣本的提取性能還需深入研究。未來(lái)，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本類型和病毒種類，開(kāi)展多中心、大樣本量的臨床驗(yàn)證，為博清生物核酸提取儀的廣泛應(yīng)用提供更全面的依據(jù)。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀采用自動(dòng)化磁珠法技術(shù)，具有提取快速、純度高、回收率高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，能夠滿足病毒感染檢測(cè)中核酸提取的需求。該儀器不僅簡(jiǎn)化了操作流程、提高了檢測(cè)效率，還提升了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，在臨床病毒感染診斷、流行病學(xué)調(diào)查及科研實(shí)驗(yàn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。