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復蘇過程中的溫度控制是決定細胞存活率的關鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋存在控溫精度低、升溫速率不均勻、溫度波動范圍大等問題，常導致細胞復蘇過程中局部溫度過高或升溫過慢，影響細胞活性。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的電熱恒溫水浴鍋作為一款專為科研場景設計的恒溫設備，采用先進的智能溫控系統(tǒng)、高效加熱模塊及均勻攪拌裝置，旨在實現(xiàn)精準、穩(wěn)定的溫度控制。本研究通過系統(tǒng)實驗，探究該設備在不同細胞系冷凍復蘇中的應用效果，為其在生命科學研究中的推廣應用提供實驗依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1、細胞系 人肝癌細胞HepG2、小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3、人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC，均購自中國科學院上海細胞庫。

2、主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）；胰蛋白酶（0.25%）、PBS緩沖液；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒。

3、實驗設備 博清生物電熱恒溫水浴鍋；傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋；超凈工作臺；CO?培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；流式細胞儀；細胞計數(shù)板。

（二）實驗方法

1、細胞培養(yǎng) 不同細胞系分別采用對應培養(yǎng)基培養(yǎng)：HepG2和NIH/3T3細胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），HUVEC細胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）。所有細胞均置于37℃、5% CO?、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細胞融合度達到80%~90%時進行傳代或冷凍處理。

2、細胞冷凍 采用梯度冷凍法進行細胞冷凍。收集對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細胞沉淀（1000r/min，5 min），用預冷的冷凍培養(yǎng)基（含10% DMSO、90% FBS）重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10? ~ 2×10? cells/mL，將細胞懸液移入凍存管中，每管1mL。將凍存管依次置于4℃冰箱30 min、-20℃冰箱2h、-80℃冰箱過夜，次日轉入液氮罐中長期保存，保存時間均為1個月。

3、細胞復蘇 實驗分為兩組：實驗組采用博清生物電熱恒溫水浴鍋復蘇，對照組采用傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋復蘇。具體操作如下：從液氮罐中取出凍存管，迅速分別放入兩組預熱至37℃的水浴鍋中，實驗組開啟博清生物水浴鍋的恒溫攪拌功能，對照組采用傳統(tǒng)水浴鍋自然升溫，兩組均持續(xù)輕輕搖晃凍存管，使細胞懸液快速、均勻升溫，至凍存管內(nèi)冰晶完全融化（約1~2 min）。復蘇完成后，將細胞懸液移入離心管中，加入5mL預熱的完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，離心收集細胞沉淀（1000r/min，5min），棄去上清液（含過量DMSO），用完全培養(yǎng)基重懸細胞，進行后續(xù)檢測。

4、溫度參數(shù)檢測 分別在兩組水浴鍋升溫至37℃并穩(wěn)定后，采用高精度溫度計（精度±0.01℃）檢測水浴鍋內(nèi)不同位置（中心、邊緣、底部）的溫度，每5min檢測一次，持續(xù)30min，記錄溫度波動范圍；同時記錄凍存管從放入水浴鍋到冰晶完全融化的時間，計算平均升溫速率。

5、細胞存活率檢測 采用臺盼藍拒染法檢測細胞復蘇后的存活率。將復蘇并重懸的細胞懸液與0.4%臺盼藍染液按1:1比例混合，靜置3min后，滴加至細胞計數(shù)板上，在倒置顯微鏡下計數(shù)活細胞（未被染色）和死細胞（被染成藍色）數(shù)量，計算細胞存活率：存活率=（活細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

6、細胞增殖活性檢測 采用CCK-8法檢測細胞復蘇后的增殖活性。將復蘇后的細胞按1×103cells/孔的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔，同時設置空白對照孔（僅加培養(yǎng)基）。將96孔板置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h，使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔吸光度（OD值），OD值越高表示細胞增殖活性越強。

7、細胞凋亡率檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染法結合流式細胞儀檢測細胞復蘇后的凋亡率。將復蘇后培養(yǎng)24h的細胞用胰蛋白酶消化，離心收集細胞沉淀（1000 r/min，5 min），用PBS緩沖液洗滌2次，加入195μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，再加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI染液，避光孵育15min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算凋亡細胞（早期凋亡+晚期凋亡）占總細胞的比例。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

二、結果

（一）兩組水浴鍋溫度性能對比

溫度穩(wěn)定性檢測結果顯示，博清生物電熱恒溫水浴鍋在37℃恒溫狀態(tài)下，不同位置（中心、邊緣、底部）的溫度波動范圍為36.9℃~37.1℃，控溫精度可達±0.1℃；而傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋的溫度波動范圍為36.5℃~37.5℃，控溫精度僅為±0.5℃。升溫速率檢測結果顯示，采用博清生物電熱恒溫水浴鍋復蘇時，凍存管內(nèi)冰晶完全融化的平均時間為1.2min，平均升溫速率為29.2℃/min；采用傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋復蘇時，平均融化時間為1.8min，平均升溫速率為18.3℃/min，兩組升溫速率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

（二）兩組水浴鍋對細胞復蘇存活率的影響

臺盼藍拒染法檢測結果顯示，三種細胞系經(jīng)博清生物電熱恒溫水浴鍋復蘇后的存活率均顯著高于傳統(tǒng)水浴鍋復蘇組（P<0.05）。其中，HepG2細胞實驗組存活率為89.6%±2.3%，對照組為77.4%±3.1%；NIH/3T3細胞實驗組存活率為91.2%±1.8%，對照組為80.5%±2.7%；HUVEC細胞實驗組存活率為87.8%±2.5%，對照組為75.6%±3.2%。結果表明，博清生物電熱恒溫水浴鍋可有效提高不同細胞系的復蘇存活率。

（三）兩組水浴鍋對細胞增殖活性的影響

CCK-8法檢測結果顯示，在培養(yǎng)24h、48h、72h后，實驗組（博清生物水浴鍋復蘇）三種細胞的OD值均顯著高于對照組（傳統(tǒng)水浴鍋復蘇）（P<0.05），且隨著培養(yǎng)時間的延長，兩組細胞的OD值均逐漸升高，但實驗組的增殖速率始終高于對照組。以HepG2細胞為例，培養(yǎng)72h后，實驗組OD值為1.86±0.08，對照組為1.42±0.06，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明博清生物電熱恒溫水浴鍋復蘇后的細胞具有更強的增殖活性，能更好地維持細胞的正常生物學功能。

（四）兩組水浴鍋對細胞凋亡率的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，實驗組三種細胞復蘇后的凋亡率均顯著低于對照組（P<0.05）。其中，HepG2細胞實驗組凋亡率為5.3%±0.8%，對照組為12.6%±1.5%；NIH/3T3細胞實驗組凋亡率為4.8%±0.6%，對照組為11.2%±1.2%；HUVEC細胞實驗組凋亡率為6.1%±0.9%，對照組為13.5%±1.6%。這表明博清生物電熱恒溫水浴鍋可有效減少細胞復蘇過程中的凋亡現(xiàn)象，更好地保護細胞結構的完整性。

三、討論

細胞冷凍復蘇技術是生命科學研究中不可或缺的關鍵技術，其核心挑戰(zhàn)在于復蘇過程中如何快速、均勻地升溫，避免冰晶再結晶對細胞造成損傷。傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋由于控溫精度低、升溫速率不均勻，常導致細胞復蘇存活率偏低，且復蘇后的細胞增殖活性和生物學特性受到影響，制約了相關科研工作的效率和質(zhì)量。博清生物電熱恒溫水浴鍋針對科研場景的需求，采用了一系列先進技術設計，在溫度控制精度和升溫均勻性方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。

本研究通過對比實驗發(fā)現(xiàn)，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的電熱恒溫水浴鍋在37℃恒溫狀態(tài)下的溫度波動范圍僅為±0.1℃，遠優(yōu)于傳統(tǒng)水浴鍋的±0.5℃，這得益于其采用的智能溫控系統(tǒng)和高精度溫度傳感器，能夠?qū)崟r監(jiān)測并調(diào)節(jié)水浴溫度，確保整個復蘇過程中溫度的穩(wěn)定性。同時，該設備的高效加熱模塊和均勻攪拌裝置使其升溫速率達到29.2℃/min，顯著高于傳統(tǒng)水浴鍋的18.3℃/min，能夠在更短的時間內(nèi)使凍存管內(nèi)的細胞懸液升溫至37℃，快速融化冰晶，減少冰晶再結晶對細胞膜和細胞器的損傷，從而提高細胞復蘇存活率。

細胞復蘇后的存活率、增殖活性和凋亡率是評價復蘇效果的核心指標。本研究結果顯示，采用博清生物電熱恒溫水浴鍋復蘇的三種不同細胞系，其存活率均較傳統(tǒng)水浴鍋提升8%~12%，且增殖活性顯著增強，凋亡率顯著降低。這一結果表明，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的電熱恒溫水浴鍋不僅能夠提高細胞復蘇的成功率，還能更好地維持細胞的正常生物學功能，為后續(xù)的細胞實驗提供高質(zhì)量的細胞材料。此外，該設備適用于多種不同類型的細胞系，具有廣泛的適用性，能夠滿足生命科學研究中多樣化的細胞復蘇需求。

本研究也存在一定的局限性，未來可進一步探討博清生物電熱恒溫水浴鍋在不同冷凍保護劑、不同冷凍時間的細胞復蘇中的應用效果，以及其在原代細胞、干細胞等特殊細胞類型冷凍復蘇中的表現(xiàn)，為其在更廣泛科研場景中的應用提供更全面的實驗依據(jù)。

本研究系統(tǒng)探討了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的電熱恒溫水浴鍋在細胞冷凍復蘇中的應用效果，結果表明該設備具備精準的溫度控制能力、穩(wěn)定的升溫效率和良好的升溫均勻性。與傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋相比，使用博清生物電熱恒溫水浴鍋進行細胞復蘇，可顯著提高細胞存活率，增強細胞增殖活性，降低細胞凋亡率，且適用于多種不同類型的細胞系。因此，博清生物電熱恒溫水浴鍋是生命科學研究中細胞冷凍復蘇的理想設備，能夠為細胞資源保存及相關科研工作提供可靠的技術支撐，具有重要的推廣應用價值。