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缺血性腦損傷是由腦血管阻塞導(dǎo)致腦組織缺氧、缺血引發(fā)的神經(jīng)功能障礙，具有高發(fā)病率、高致殘率的特點(diǎn)，其病理機(jī)制及治療靶點(diǎn)研究依賴(lài)穩(wěn)定的體外模型。體外細(xì)胞模型構(gòu)建的核心在于精準(zhǔn)模擬體內(nèi)缺血微環(huán)境，其中缺氧（低氧濃度）和酸堿平衡（CO?濃度調(diào)控）的穩(wěn)定維持是關(guān)鍵因素。

傳統(tǒng)普通培養(yǎng)箱僅能調(diào)控CO?濃度和溫度，無(wú)法實(shí)現(xiàn)低氧環(huán)境的精準(zhǔn)、持續(xù)控制，導(dǎo)致缺血模型穩(wěn)定性差、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性低，制約了研究進(jìn)展。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱可同時(shí)精準(zhǔn)調(diào)控O?、CO?和N?濃度，結(jié)合高精度控溫系統(tǒng)，能模擬不同缺血程度的微環(huán)境，為缺血性腦損傷細(xì)胞模型的標(biāo)準(zhǔn)化構(gòu)建提供可能。本研究以大鼠皮層神經(jīng)元為研究對(duì)象，系統(tǒng)評(píng)估博清生物三氣培養(yǎng)箱在缺血性腦損傷模型構(gòu)建中的應(yīng)用效果，為神經(jīng)科學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)支撐。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、細(xì)胞：新生SD大鼠皮層神經(jīng)元（分離自出生24h內(nèi)大鼠）；

2、儀器：博清生物三氣培養(yǎng)箱、普通CO?培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、電泳系統(tǒng)、免疫熒光顯微鏡；

3、試劑：神經(jīng)元專(zhuān)用培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8試劑盒、LDH釋放檢測(cè)試劑盒、Annexin V - FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、Caspase-3抗體、β-actin 抗體、二抗等。

（二）實(shí)驗(yàn)分組

1、正常對(duì)照組：神經(jīng)元在常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境（21% O?、5% CO?、37℃）中培養(yǎng)；

2、缺血模型組（博清生物三氣培養(yǎng)箱組）：神經(jīng)元在模擬缺血環(huán)境（1% O?、5% CO?、94% N?、37℃）中培養(yǎng)；

3、對(duì)照組（普通培養(yǎng)箱組）：嘗試通過(guò)密封培養(yǎng)瓶減少氧氣接觸模擬缺血，其余條件同正常對(duì)照組。

（三）實(shí)驗(yàn)方法

1、大鼠皮層神經(jīng)元分離與培養(yǎng)

新生SD大鼠消毒后取大腦皮層，剝離腦膜，剪碎組織后用胰蛋白酶消化，終止消化后吹打制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾后接種于包被多聚賴(lài)氨酸的培養(yǎng)板中，加入神經(jīng)元專(zhuān)用培養(yǎng)基，置于常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)3d后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)7d用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2、缺血性腦損傷模型構(gòu)建

神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，缺血模型組轉(zhuǎn)移至博清生物三氣培養(yǎng)箱中，設(shè)置參數(shù)為1% O?、5% CO?、37℃，持續(xù)培養(yǎng)6h構(gòu)建缺血損傷模型；對(duì)照組在普通培養(yǎng)箱中，將培養(yǎng)瓶密封后培養(yǎng)6h；正常對(duì)照組繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)6h。

3、指標(biāo)檢測(cè)

細(xì)胞活力檢測(cè)：采用CCK-8法，模型構(gòu)建后向各孔加入CCK-8試劑，孵育2h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力；

細(xì)胞損傷檢測(cè)：采用 LDH 釋放法，收集培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)490nm處吸光度值，評(píng)估細(xì)胞膜損傷程度；

細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用Annexin V-FITC/PI雙染法，收集細(xì)胞后加入染色液孵育15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率；

蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Western blot法，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入Caspase-3和β-actin一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育后顯影，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）細(xì)胞活力變化

正常對(duì)照組細(xì)胞活力為（98.6±2.3）%；缺血模型組（博清生物三氣培養(yǎng)箱組）細(xì)胞活力顯著下降至（42.3±3.5）%；對(duì)照組（普通培養(yǎng)箱組）細(xì)胞活力為（78.5±4.2）%。缺血模型組細(xì)胞活力顯著低于正常對(duì)照組和對(duì)照組（P<0.05），且組內(nèi)數(shù)據(jù)差異較小（變異系數(shù)<5%），對(duì)照組數(shù)據(jù)波動(dòng)較大（變異系數(shù)>10%）。

（二）細(xì)胞膜損傷程度

正常對(duì)照組LDH釋放率為（12.5±1.8）%；缺血模型組LDH釋放率顯著升高至（68.7±4.1）%；對(duì)照組LDH釋放率為（35.2±5.3）%。缺血模型組LDH釋放率顯著高于其他兩組（P<0.05），且結(jié)果穩(wěn)定性?xún)?yōu)于對(duì)照組。

（三）細(xì)胞凋亡率變化

正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.2±0.8）%；缺血模型組凋亡率顯著升高至（45.6±3.2）%；對(duì)照組凋亡率為（18.9±4.5）%。缺血模型組凋亡率顯著高于正常對(duì)照組和對(duì)照組（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

（四）Caspase-3蛋白表達(dá)

與正常對(duì)照組相比，缺血模型組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；對(duì)照組Caspase-3蛋白表達(dá)雖有升高，但幅度顯著低于缺血模型組，且組間差異較大。

三、討論

缺血性腦損傷的核心病理環(huán)節(jié)是缺氧引發(fā)的神經(jīng)元損傷與凋亡，體外模型需精準(zhǔn)復(fù)現(xiàn)這一核心特征。本研究中，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱通過(guò)精準(zhǔn)調(diào)控O?濃度至1%，成功模擬了腦缺血后的缺氧微環(huán)境，誘導(dǎo)神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的活力下降、細(xì)胞膜損傷及凋亡增加，且Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，這些變化與體內(nèi)缺血性腦損傷的病理特征高度一致。

相比之下，普通培養(yǎng)箱通過(guò)密封方式模擬缺血，無(wú)法精準(zhǔn)控制氧濃度，導(dǎo)致模型組細(xì)胞損傷程度較輕且結(jié)果波動(dòng)較大，難以滿(mǎn)足科研實(shí)驗(yàn)對(duì)穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。博清生物三氣培養(yǎng)箱的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在三個(gè)方面：一是氧濃度調(diào)控精度高（0.1%~21%），可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置不同低氧梯度，適配不同缺血程度的模型構(gòu)建；二是三氣（O?、CO?、N?）協(xié)同調(diào)控，維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的酸堿平衡和滲透壓穩(wěn)定，減少非特異性損傷；三是控溫精度達(dá)±0.1℃，避免溫度波動(dòng)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響，進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

本研究證實(shí)，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱構(gòu)建的缺血性腦損傷細(xì)胞模型更貼近體內(nèi)病理狀態(tài)，且具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可為缺血性腦損傷的分子機(jī)制研究、藥物篩選及療效評(píng)估提供可靠的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。后續(xù)研究可利用該儀器探索不同缺血時(shí)間、不同氧濃度對(duì)神經(jīng)元損傷的影響，進(jìn)一步優(yōu)化模型構(gòu)建方案。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱通過(guò)精準(zhǔn)調(diào)控低氧環(huán)境，成功構(gòu)建了穩(wěn)定、可靠的缺血性腦損傷神經(jīng)元模型，其誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡特征更貼近體內(nèi)病理狀態(tài)，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)普通培養(yǎng)箱的模擬方法。該儀器為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中缺血性腦損傷的體外研究提供了高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)工具，具有重要的科研應(yīng)用價(jià)值。