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生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展推動(dòng)了診斷試劑向精準(zhǔn)化、快速化、便攜化方向升級(jí)，其中核酸診斷試劑因直接靶向病原體或疾病相關(guān)基因，成為感染性疾病診斷、遺傳病篩查、腫瘤早篩等領(lǐng)域的核心產(chǎn)品。熒光定量PCR技術(shù)作為核酸檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其檢測(cè)性能直接決定診斷試劑的靈敏度、特異性及臨床適用性，而PCR儀的硬件性能是技術(shù)落地的關(guān)鍵支撐。

目前，國(guó)內(nèi)診斷試劑開(kāi)發(fā)領(lǐng)域?qū)Ω咝阅堋⒏咝詢r(jià)比的國(guó)產(chǎn)熒光定量PCR儀需求迫切。博清生物科技（南京）有限公司針對(duì)診斷試劑開(kāi)發(fā)的核心痛點(diǎn)，研發(fā)了兼具精準(zhǔn)性與實(shí)用性的熒光定量PCR儀，在光學(xué)設(shè)計(jì)、溫控精度、軟件適配性等方面進(jìn)行專項(xiàng)優(yōu)化。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)儀器

博清生物熒光定量PCR儀，配備多通道光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，溫控范圍4℃~100℃，升溫速率6℃/s，降溫速率6℃/s；進(jìn)口儀器為某品牌熒光定量PCR儀。

（二）實(shí)驗(yàn)材料

1、靶標(biāo)核酸：新冠病毒（S基因）、甲型流感病毒（HA基因）、大腸桿菌（uidA基因）重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（濃度梯度101~10?copies/μL）。

2、試劑耗材：PCR反應(yīng)預(yù)混液（含Taq酶、dNTPs、熒光染料）、特異性引物探針（由生工生物合成）、無(wú)酶純水、臨床模擬樣本（滅活病毒液、細(xì)菌培養(yǎng)液、健康人血清）。

（三）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、反應(yīng)體系優(yōu)化

以新冠病毒S基因?yàn)榘袠?biāo)，采用博清生物PCR儀，設(shè)置引物濃度（0.2~0.5μmol/L）、探針濃度（0.1~0.3μmol/L）、退火溫度（55~65℃）三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，以Ct值、擴(kuò)增效率（E）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最優(yōu)反應(yīng)體系。

2、特異性驗(yàn)證

選取新冠病毒、甲型流感病毒、大腸桿菌及人類管家基因（GAPDH）核酸樣本，使用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證儀器對(duì)特異性引物探針的識(shí)別能力。

3、靈敏度與線性范圍檢測(cè)

采用101~10?copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)（R2）、擴(kuò)增效率，確定儀器的檢測(cè)下限（LOD）。

4、重復(fù)性評(píng)估

對(duì)103、10?、10?copies/μL三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行批內(nèi)（n=8）和批間（n=3，連續(xù)3天）檢測(cè)，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)（CV）。

5、臨床樣本適配性驗(yàn)證

使用優(yōu)化后的診斷試劑配方，對(duì)50份臨床模擬樣本（含25份陽(yáng)性樣本、25份陰性樣本）進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比博清生物PCR儀與進(jìn)口儀器的檢測(cè)一致性。

二、結(jié)果與分析

（一）反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)引物濃度0.3μmol/L、探針濃度0.2μmol/L、退火溫度60℃時(shí)，擴(kuò)增效果最佳。此時(shí)Ct值平均為22.3±0.5，擴(kuò)增效率E=98.7%，符合診斷試劑開(kāi)發(fā)的效率要求（90%~110%）。博清生物PCR儀的精準(zhǔn)溫控能力的體現(xiàn)，可快速鎖定最優(yōu)退火溫度，縮短體系優(yōu)化周期。

（二）特異性驗(yàn)證結(jié)果

僅靶標(biāo)核酸樣本出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，非靶標(biāo)樣本及空白對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，交叉反應(yīng)率為0。表明該儀器的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)可有效區(qū)分特異性熒光信號(hào)與背景噪音，保障診斷試劑的特異性。

（三）靈敏度與線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線分析顯示，在101~10?copies/μL濃度范圍內(nèi)，R2=0.999，擴(kuò)增效率E=99.2%。檢測(cè)下限（LOD）為101copies/μL，與進(jìn)口儀器檢測(cè)結(jié)果一致，滿足臨床診斷試劑對(duì)低濃度樣本的檢出需求。

（四）重復(fù)性表現(xiàn)

批內(nèi)檢測(cè)CV值為1.2%~2.5%，批間檢測(cè)CV值為1.8%~2.8%，均低于3%的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明博清生物PCR儀的溫控穩(wěn)定性和光學(xué)檢測(cè)一致性良好，可保障診斷試劑批間差異控制在合理范圍。

（五）臨床樣本適配性

50份臨床模擬樣本檢測(cè)中，博清生物PCR儀與進(jìn)口儀器的陽(yáng)性檢出率均為100%，陰性符合率100%，一致性kappa值=1.0。表明該儀器可適配臨床樣本基質(zhì)，滿足診斷試劑臨床驗(yàn)證階段的檢測(cè)需求。

三、討論

診斷試劑開(kāi)發(fā)的核心訴求是兼顧性能可靠性與開(kāi)發(fā)效率，而PCR儀的硬件性能直接影響試劑配方優(yōu)化、性能驗(yàn)證的周期與效果。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在本次實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出三大核心優(yōu)勢(shì)：

首先，精準(zhǔn)的溫控系統(tǒng)與多通道光學(xué)設(shè)計(jì)，保障了反應(yīng)體系優(yōu)化的高效性和特異性驗(yàn)證的準(zhǔn)確性。其快速升降溫能力可將單次擴(kuò)增周期縮短至40分鐘內(nèi)，相比傳統(tǒng)儀器提升30%效率，顯著加快試劑開(kāi)發(fā)進(jìn)程。

其次，寬線性范圍與高靈敏度，可覆蓋從低濃度病原體檢測(cè)到高濃度樣本定量的全場(chǎng)景需求，適用于感染性疾病早期診斷、療效監(jiān)測(cè)等不同用途的試劑開(kāi)發(fā)。

最后，良好的兼容性與重復(fù)性，使其可適配市面上主流的PCR預(yù)混液、引物探針，且批間差異小，為診斷試劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了穩(wěn)定的檢測(cè)平臺(tái)。

與進(jìn)口儀器相比，博清生物熒光定量PCR儀在核心性能指標(biāo)上已實(shí)現(xiàn)持平，且在軟件操作的本土化適配、售后響應(yīng)速度等方面更具優(yōu)勢(shì)，可降低國(guó)內(nèi)診斷試劑企業(yè)的開(kāi)發(fā)成本與技術(shù)門(mén)檻。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀憑借精準(zhǔn)的溫控性能、高靈敏度的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)及良好的兼容性，可高效適配診斷試劑開(kāi)發(fā)的全流程，包括反應(yīng)體系優(yōu)化、特異性驗(yàn)證、靈敏度標(biāo)定及臨床樣本驗(yàn)證。其核心性能達(dá)到行業(yè)先進(jìn)水平，能為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中核酸診斷試劑的快速開(kāi)發(fā)與產(chǎn)業(yè)化提供可靠技術(shù)支撐，助力國(guó)產(chǎn)診斷試劑的自主創(chuàng)新與市場(chǎng)推廣。未來(lái)可進(jìn)一步拓展儀器在數(shù)字PCR、多重檢測(cè)等高端應(yīng)用場(chǎng)景的適配性，滿足更復(fù)雜的診斷試劑開(kāi)發(fā)需求。