核酸提取是水體微生物分子分析的第一步，其質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。傳統(tǒng)核酸提取方法（如酚氯仿法、離心柱法）存在操作繁瑣、耗時(shí)較長（單次提取需2-3小時(shí)）、人為誤差大等問題，且易因水體中腐殖酸、重金屬等抑制劑殘留，導(dǎo)致核酸純度低、后續(xù)PCR擴(kuò)增抑制。尤其針對低生物量水體（如寡營養(yǎng)湖泊）或高污染水體（如工業(yè)廢水），傳統(tǒng)方法往往難以兼顧提取效率與核酸質(zhì)量，限制了微生物分析的精準(zhǔn)性。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀基于磁珠法原理，集成樣品裂解、核酸結(jié)合、洗滌、洗脫全流程自動化，可實(shí)現(xiàn)16個(gè)樣品同時(shí)處理，單次提取時(shí)間縮短至30分鐘以內(nèi)。該儀器通過優(yōu)化裂解緩沖液配方與磁珠吸附條件，可減少抑制劑殘留、提高核酸回收率。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、水樣采集

每類水體設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)采樣點(diǎn)：

河流樣品（R）：采集某市城區(qū)河流表層水；

湖泊樣品（L）：采集城郊淡水湖泊表層水；

近海樣品（M）：采集近?？诒韺铀?。

所有水樣采集后立即置于4℃保溫箱中，24小時(shí)內(nèi)完成預(yù)處理。

2、主要試劑與儀器

儀器：博清生物核酸提取儀；超微量分光光度計(jì)；熒光定量PCR儀；高通量測序儀；電泳儀。

試劑：博清生物磁珠法水體微生物核酸提取試劑盒；傳統(tǒng)酚氯仿提取試劑；基因高通量測序試劑盒；基因qPCR試劑盒；瓊脂糖。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、水樣預(yù)處理

取100mL水樣，通過0.22μm聚碳酸酯濾膜真空抽濾富集微生物；將濾膜剪碎后轉(zhuǎn)入50mL 離心管，加入10mL無菌PBS緩沖液，渦旋振蕩10分鐘，4℃、8000rpm 離心10分鐘，收集菌體沉淀，用于后續(xù)核酸提取。

2、核酸提取

設(shè)置兩組提取方法，每組3次重復(fù)：

博清儀器組：按照核酸提取儀操作說明書，取菌體沉淀加入500μL裂解液，渦旋混勻后轉(zhuǎn)入儀器專用反應(yīng)板；設(shè)置提取程序：裂解溫度56℃、時(shí)間10分鐘，磁珠結(jié)合時(shí)間5分鐘，洗滌次數(shù)3次，洗脫溫度70℃、時(shí)間5分鐘；最終洗脫體積為50μL，收集核酸溶液。

傳統(tǒng)方法組：采用酚氯仿法：菌體沉淀中加入500μL裂解液（含1% SDS、10mmol/L EDTA），65℃水浴30分鐘；加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），渦旋2分鐘，4℃、12000rpm 離心10分鐘；取上清液，重復(fù)酚氯仿抽提1次；加入0.8倍體積異丙醇，-20℃沉淀30分鐘；4℃、12000rpm離心15分鐘，沉淀用75%乙醇洗滌2次，晾干后用50μL無菌水溶解，即得核酸溶液。

3、核酸質(zhì)量檢測

濃度與純度：使用超微量分光光度計(jì)檢測核酸濃度（ng/μL）及A260/A280、A260/A230 比值。

完整性：采用1%瓊脂糖凝膠電泳（120V、30分鐘），EB染色后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察核酸條帶，判斷是否存在降解（完整核酸條帶為清晰單一亮帶，無彌散）。

4、水體微生物分析

高通量測序：以提取的核酸為模板，擴(kuò)增16S rRNA基因V4-V5區(qū)；PCR產(chǎn)物純化后構(gòu)建Illumina文庫，通過MiSeq平臺測序；使用QIIME2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì) OTU（操作分類單元）數(shù)量、Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)，并進(jìn)行物種注釋。

qPCR檢測：以氨氧化細(xì)菌amoA基因?yàn)槟繕?biāo)；反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR Premix Ex Taq 10μL，上下游引物各0.8μL，模板核酸2μL，無菌水6.4μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，40個(gè)循環(huán)；記錄Ct值，計(jì)算擴(kuò)增效率。

5、數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著；使用R4.2.0軟件繪制物種相對豐度熱圖及多樣性指數(shù)箱線圖。

二、結(jié)果與分析

（一）核酸提取質(zhì)量對比

1、濃度與純度

不同水體樣品中，博清儀器組的核酸提取濃度均顯著高于傳統(tǒng)方法組：河流樣品中，博清組濃度為62.1±3.5ng/μL，傳統(tǒng)組為35.8±2.9ng/μL；湖泊樣品中，博清組為55.3±4.1 ng/μL，傳統(tǒng)組為30.2±3.2ng/μL；近海樣品中，博清組為57.2±3.8ng/μL，傳統(tǒng)組為31.5±2.7ng/μL。

純度方面，博清儀器組的A260/A280比值穩(wěn)定在1.85-1.95，符合純DNA標(biāo)準(zhǔn)；而傳統(tǒng)方法組因蛋白殘留，A260/A280比值普遍為1.55-1.68，低于標(biāo)準(zhǔn)范圍。A260/A230比值中，博清組均>2.0（2.05-2.18），表明抑制劑殘留少；傳統(tǒng)組則為1.2-1.5，提示存在腐殖酸或鹽類殘留。

2、核酸完整性

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，博清儀器組提取的核酸條帶清晰單一，無明顯彌散，表明核酸完整性好，無降解；而傳統(tǒng)方法組的核酸條帶存在不同程度的彌散現(xiàn)象，尤其河流樣品（高污染）的彌散更明顯，提示核酸降解嚴(yán)重，可能與傳統(tǒng)方法操作步驟多、暴露時(shí)間長有關(guān)。

（二）高通量測序結(jié)果對比

1、群落豐富度與多樣性

博清儀器組的OTU數(shù)量顯著高于傳統(tǒng)方法組：河流樣品中，博清組OTU為1923±85，傳統(tǒng)組為1286±68；湖泊樣品中，博清組為1815±76，傳統(tǒng)組為1192±59；近海樣品中，博清組為1740±92，傳統(tǒng)組為1167±71。

多樣性指數(shù)方面，博清儀器組的Shannon指數(shù)（反映群落多樣性）顯著高于傳統(tǒng)方法組（P<0.05），而Simpson指數(shù)（反映群落優(yōu)勢度）顯著低于傳統(tǒng)方法組（P<0.05），表明博清儀器提取的核酸能更全面地反映水體微生物的群落多樣性，減少低豐度物種的遺漏。

2、物種組成與注釋

物種注釋結(jié)果顯示，博清儀器組的物種注釋率（98.2%-99.1%）高于傳統(tǒng)方法組（92.5%-94.3%）。在門水平上，兩組均以變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門為主，但博清組能檢出傳統(tǒng)方法組遺漏的低豐度門；在屬水平上，博清組檢出的潛在功能屬豐度更接近實(shí)際水體情況，而傳統(tǒng)方法組因抑制劑殘留，部分功能屬的豐度被低估。

（三）qPCR檢測結(jié)果對比

以amoA基因?yàn)槟繕?biāo)的qPCR結(jié)果顯示，博清儀器組的Ct值顯著低于傳統(tǒng)方法組（P<0.05），擴(kuò)增效率顯著高于傳統(tǒng)方法組（P<0.05）：河流樣品中，博清組Ct值為23.8±0.4，擴(kuò)增效率98.5%；傳統(tǒng)組Ct值為28.2±0.7，擴(kuò)增效率83.1%。這表明博清儀器提取的核酸中抑制劑殘留少，模板質(zhì)量高，更適合后續(xù)定量分析。

三、討論

本研究通過對比實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了博清生物核酸提取儀在水體微生物分析中的優(yōu)勢，其核心性能提升可歸因于以下三點(diǎn)：

（一）自動化磁珠法的高效性：傳統(tǒng)酚氯仿法依賴人工操作，步驟繁瑣且易因離心、移液誤差導(dǎo)致核酸損失；而博清儀器采用磁珠法，通過自動化控制裂解溫度、結(jié)合時(shí)間等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)核酸的高效吸附與洗脫，顯著提升提取濃度（平均提升79%），且單次提取時(shí)間縮短至30分鐘，滿足環(huán)境監(jiān)測中“快速批量分析”的需求（如突發(fā)水污染事件的應(yīng)急檢測）。

（二）抑制劑殘留的有效控制：水體中的腐殖酸、重金屬等抑制劑是影響核酸質(zhì)量的關(guān)鍵因素——傳統(tǒng)方法僅通過酚氯仿抽提去除雜質(zhì)，效果有限；而博清儀器配套試劑盒中的洗滌緩沖液可特異性結(jié)合抑制劑，通過多次自動化洗滌（3次）顯著降低殘留，表現(xiàn)為A260/A230比值>2.0，進(jìn)而減少對后續(xù)PCR的抑制。

（三）微生物群落的精準(zhǔn)表征：低豐度微生物（如功能型氨氧化細(xì)菌）往往是水體生態(tài)過程的關(guān)鍵驅(qū)動者，但傳統(tǒng)方法因提取效率低易導(dǎo)致其漏檢；博清儀器通過高回收率（核酸濃度提升）和低抑制劑殘留，顯著提高OTU數(shù)量（平均提升50%）及低豐度物種檢出率，使群落多樣性指數(shù)更接近實(shí)際水體情況，為生態(tài)研究中“微生物功能-環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析”提供可靠數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

在環(huán)境監(jiān)測應(yīng)用中，博清儀器的優(yōu)勢可具體體現(xiàn)為：針對高污染水體，其可快速提取高質(zhì)量核酸，通過qPCR檢測致病菌或功能基因，實(shí)現(xiàn)水質(zhì)污染程度的快速評估；針對寡營養(yǎng)水體，其高靈敏度可檢出低豐度微生物，為早期生態(tài)退化的預(yù)警提供依據(jù)。在生態(tài)研究中，該儀器可支撐長期動態(tài)監(jiān)測，通過批量處理樣品減少人為誤差，提升數(shù)據(jù)的可比性。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀在水體微生物核酸提取中表現(xiàn)出高濃度、高純度、高自動化的優(yōu)勢，其提取的核酸可滿足高通量測序、qPCR等后續(xù)分子生物學(xué)分析的要求，顯著提升水體微生物群落表征的精準(zhǔn)性。該儀器可有效解決傳統(tǒng)方法操作繁瑣、抑制劑殘留多、低豐度物種漏檢等問題，為環(huán)境監(jiān)測中的水質(zhì)快速評價(jià)及生態(tài)研究中的微生物功能解析提供高效、可靠的技術(shù)支撐，具有廣泛的應(yīng)用前景。